在当今高速运转的社会，压力无处不在。生活、家庭、工作均会带给我们压力，抗压能力正逐渐被大家重视，大量抗压培训机构应运而生。当长期压力的累积超过心理负担时，可能会引起重度抑郁症（Major Depressive Disorder, MDD）等神经疾病，十分危险。
解决压力带来的神经疾病，仅凭外部的心理治疗是不够的，我们还需了解其致病内因。事实上，不同个体的先天抗压能力是不同的。在小鼠慢性社交挫败压力（Chronic social defeat stress， CSDS）范式中，部分小鼠极易产生抑郁倾向，我们称之为易感型（susceptible）小鼠；另一部分小鼠具有很强的压力抗性，称之为抵抗型（resilient）小鼠[1, 2]。CSDS范式可以在一定程度上还原社会压力引起人类抑郁的情景。
大家都可以想到，如果找出抵抗型小鼠和易感型小鼠转录水平不同的基因，我们便可成功找到抗压差异性的内因。然而，事实并非如此简单，因为抵抗型小鼠并非只是不易感，还会产生大量应激反应以抵抗压力。因此，抵抗型小鼠多脑区多基因转录水平均会发生变化[3]，而这些基因之间的关联性尚未可知。
2019年8月19日，《Nature Neuroscience》杂志在线刊登了美国西奈山伊坎医学院Eric J. Nestler研究组的最新重要工作[4]，他们发现PFC脑区中Zfp189为压力抗性的关键驱动基因，CREB为Zfp189基因网络的重要调节因子。这项研究揭示了Zfp189与CREB在压力抗性基因网络中的核心作用，极大提高了人们在抑郁情绪领域中的认知。
图片来源：Icahn School of Medicine at Mount Sinai
通过加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA），我们可根据转录调控将基因聚集成模块（module）。WGCNA通过RNA测序定义基因网络，已应用于多种复杂神经疾病，如精神分裂症[5]、PD[6]、AD[7]等。
为探究压力抗性与基因转录水平之间的关系，作者整合WGCNA与小鼠经历CSDS范式后RNA测序结果，将前额叶皮层（PFC）等四个脑区基因分成30个模块，发现不同脑区之间只有两个模块富含差异表达表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）,其中只有一个模块——粉色模块是压力抗性特有的且在多脑区转录活跃（图1a-b）。他们根据基因相关性重构粉色模块基因网络，发现其最强的关键驱动基因为Zfp189，此基因在人类MDD患者样本中转录水平显著下降（图1c-e）.过去研究表明，PFC与压力抗性密切相关[8]。为探究PFC 神经元中Zfp189的作用，作者在小鼠PFC中注射HSV-Zfp189，使用社交障碍范式训练小鼠，发现小鼠社交行为显著增加，糖水偏好实验（SPT）中摄糖量也显著增加（图1f-h）；在CSDS范式训练后的小鼠PFC中注射HSV-Zfp189，发现小鼠社交行为与摄糖量恢复正常（图1i-k）,表明PFC 神经元中过表达Zfp189增加小鼠的压力抗性，同时具有抗抑郁效应。
为研究上文中Zfp189过表达带来的影响，作者取出病毒感染的组织并进行RNA测序，发现PFC神经元过表达Zfp189后，12个模块转录上调，4个模块转录下调。其中粉色模块33.1%基因转录上调，7.1%基因转录下调，且Zfp189表达水平与粉色模块第一主成分（PC1）转录水平呈正相关，粉色模块的转录变化远高于其它模块（图2a-d）。此外，Zfp189表达水平与粉色模块PC1转录水平均与小鼠压力抗性呈正相关（图2e-f）。
图2 Zfp189基因的抗抑郁效应与粉色模块的表达变化密切相关
接下来，作者研究粉色模块如何被调控。首先，他们使用HOMER基序分析方法[9]，预测转录因子Atf1和Creb为粉色模块的上游调控因子（图3a）。然后，他们通过独创性通路分析（Ingenuity pathways analysis, IPA）进一步验证Creb为粉色模块的上游调控因子（图3b-e）。为进一步探究PFC中Creb与Zfp189的作用是否参与压力抗性，作者收集MDD患者与正常人大脑PFC样品，发现Creb表达水平与Zfp189的表达水平呈正相关，正常人大脑中其正相关性更高，而Creb总表达水平无显著差异（图3f-g），表明MDD患者PFC中Creb-Zfp189相互作用减少。
4.PFC中Creb-Zfp189相互作用调控压力抗性
为证实PFC脑区Creb的表达与压力抗性有关，作者在Crebfl/fl小鼠的PFA中注射AAV-Cre，给予小鼠低强度社交障碍压力（图4a），发现敲除PFC神经元Creb后，Zfp189转录水平下调，小鼠在低压力条件下会产生社交障碍，而正常小鼠不会（图4b-d）。
为探究Zfp189的转录水平下调是否参与上述过程，作者在Crebfl/fl小鼠的PFA中注射AAV-Cre与HSV-Zfp189，发现敲除PFC神经元Creb同时过表达Zfp189后，小鼠在低社交压力条件下不再产生社交障碍，SPF实验中摄糖量也显著增加（图4e-g）。他们又引入雌性小鼠，得到相同结果（图4h-j）。
综上，小鼠PFC中Creb和Zfp189的表达水平均与压力抗性正相关，其中Creb为信号上游，Zfp189为信号下游。
图4 PFC中Creb-Zfp189相互作用调控压力抗性
5.CRISPR介导的CREB-Zfp189相互作用增强压力抗性
为进一步证实Creb表达的蛋白CREB作用于基因Zfp189，且此作用参与压力抗性，作者引入CRISPR基因座特异性编辑方法，靶向CREB与Zfp189基因启动子的结合位点。他们将dCas9与CREB激活性突变体融合（dCas9-CREBS133D），并设计靶向Zfp189共同基序CRE附近启动子的sgRNA（Zfp189-sgRNA），Zfp189-sgRNA在CRE前~150碱基对位置靶向dCas9-CREBS133D以诱导Zfp189表达（图5a-b）。然后，他们在小鼠PFC中注射HSV-dCas9-CREBS133D和HSV-Zfp189-sgRNA，给予小鼠高强度社交障碍压力，发现诱导PFC神经元Zfp189基因高表达后，小鼠表现出更强的压力抗性（图5c-g）,表明PFC神经元中CREB-Zfp189的作用可充分提高小鼠的压力抗性。接着作者在小鼠PFC中注射HSV-dCas9-G9a和HSV-Zfp189-sgRNA以抑制Zfp189基因表达，小鼠在低强度社交障碍压力条件下表现出更弱的压力抗性（图5h-j）。
图5 CRISPR介导的CREB-Zfp189相互作用增强压力抗性
最后，为探究CREB的作用是否改变整个粉色模块的基因表达水平，作者取出HSV-dCas9-CREBS133D侵染的小鼠PFC组织，进行RNA测序，发现粉色和绿色模块转录水平均有上调（图6a），粉色模块中一些基因转录水平也有上调（图6b），表明整个粉色模块的基因表达水平受CREB-Zfp189相互作用影响。
图6 CRISPR介导的CREB-Zfp189相互作用激活粉色模块
总结
压力无处不在，持续的压力会导致重度抑郁。不同个体的抗压能力不同，过去的研究发现抵抗型小鼠对社交压力的抗性显著高于易感型小鼠。但是，抵抗型小鼠多脑区多基因转录水平均会发生变化，对于其中的核心脑区与关键基因，我们知之甚少。本篇文章结合RNA测序、WGCNA、基因过表达、CRISPR、行为学等方法，发现PFC脑区中Zfp189为压力抗性的关键驱动基因，CREB为Zfp189网络的重要调节因子，增加Zfp189表达可加强小鼠的压力抗性，而减少Zfp189表达会弱化小鼠的压力抗性。这项研究阐释了调节压力抗性的基因网络，为我们排忧解难、减轻压力提供有力支持！
Nestler研究组通过RNA测序、WGCNA、基因过表达、行为学等技术手段发现提高压力抗性的关键基因。和元病毒库中有丰富多样的病毒载体，质量严格把关，经由多实验组验证，欢迎大家选购！
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1.Berton, O., et al., Essential role of BDNF in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science, 2006. 311(5762): p. 864-8.2.Krishnan, V., et al., Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell, 2007. 131(2): p. 391-404.3.Bagot, R.C., et al., Circuit-wide Transcriptional Profiling Reveals Brain Region-Specific Gene Networks Regulating Depression Susceptibility. Neuron, 2016. 90(5): p. 969-83.4.Lorsch, Z.S., et al., Stress resilience is promoted by a Zfp189-driven transcriptional network in prefrontal cortex. Nat Neurosci, 2019. 22(9): p. 1413-1423.5.Maschietto, M., et al., Co-expression network of neural-differentiation genes shows specific pattern in schizophrenia. BMC Med Genomics, 2015. 8: p. 23.6.Yue, Z.L., et al., Repositioning drugs by targeting network modules: a Parkinson's disease case study. Bmc Bioinformatics, 2017. 18.7.Zhang, B., et al., Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer's disease. Cell, 2013. 153(3): p. 707-20.8.Covington, H.E., 3rd, et al., Antidepressant effect of optogenetic stimulation of the medial prefrontal cortex. J Neurosci, 2010. 30(48): p. 16082-90.9.Heinz, S., et al., Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell, 2010. 38(4): p. 576-89.